博济医药科技股份有限公司
股票代码为(300404)创建于2002年,2015年在深圳创业板上市,是一家为国内外医药企业提供药品、保健品、医疗器械研发与生产全流程“一站式”外包服务(CRO)的型高新技术企业,同也提供药品上市许可持有人(MAH)服务。
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药品研发“一站式”服务包括:新药立项研究和活性筛选、药学研究(含中试生产)、药理毒理研究、临床用药与模拟剂的生产、临床试验、临床数据管理和统计分析、上市后再评价、技
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公司新闻
袁来如此|大分子生物分析概论(六)上:LBA定量抗体药物的背景干扰及其消除
作者:广州博济医药 时间:2021-04-07 来源:广州博济医药

在临床前和临床研究中,LBA是用于定量分析抗体生物药、抗药物抗体和可溶性蛋白生物标志物浓度的重要方法之一。但由于研究样本主要由复杂的生物基质组成,这些基质可能表现出一定的干扰性,从而导致不准确的定量结果。本文将着重讨论在药物开发过程中如何缓解或消除对LBA定量分析方法干扰的策略,重点关注抗体生物药的定量分析。


由于篇幅有限,本文将采用上下篇的形式来展开论述,敬请垂注!

1.导论

抗体生物药在批准上市的生物药中占有很大的比例。


自1986年首次批准鼠抗体Muronomab-CD3上市,到2013年通过Glyco工程人源化的obinutuzumab上市以来,共36个抗体药物获批用于治疗人类疾病。开发抗体药物的一个重要部分是分析药物的药(毒)代动力学/(PK/TK),药效动力学(PD)和免疫原性(immunogenicity)表征。


动物研究中的PK和PD数据可用于PK/PD建模,并指导人体首次剂量的选择,随后可以启动PK/PD迭代建模和仿真(simulation)的过程,从而完善从早期到晚期的临床开发过程中的剂量选择。可靠的PK和PD数据是成功地进行 PK/PD 建模和仿真的先决条件,生物药的免疫原性也能对其PK产生很大的影响,是临床安全评估的重要组成部分。


此外,在临床研究中准确评估适当的生物标志物可以为靶标参与度、药理机制证明和原理证明以及选择最有可能对药物作出响应的患者群体提供有价值的信息。


免疫测试方法(Immunoassays)或更广义地称为配体结合式测试方法(ligand binding assays, LBA)是一种常用的分析方法,用于测定抗体药物、抗药物抗体(ADA)和可溶性蛋白生物标志物(soluble protein biomarkers)。这些测试针对的生物样本是复杂的基质,包含各种成分,其可以显著地影响定量待测物的准确性。对分析方法的干扰(interference)之前在文献中讨论过,但关注的重点是临床化验室中所使用的化验方法,药物开发过程中使用的许多检测方法是定制开发的,对其表征也较少。


本文将侧重于用于评估定量分析抗体生物药浓度和ADA时遇到的干扰以及缓解干扰的策略。


2.什么是干扰

关键术语

干扰测定值与实际值不同的现象。干扰可能来自物质(substances)、测试程序、试剂和样本的采集/处理。

相关文献中之前提出干扰的定义是:样品中存在的物质,其发挥影响或效应改变了对一个待测物的正确的分析结果;该结果通常表达为待测物的浓度或活性数值。干扰可以区分为依赖于待测物的和不依赖于待测物的两类。依赖于待测物的干扰包括直接影响对待测物的检测(detection of the analyte)的所有因素。不依赖于待测物的干扰能够在没有待测物的情况下产生检测信号,或直接抑制测试试剂。干扰导致结果的不真实可以是增加的或者减少的。

基质干扰:导致测定的待测物浓度与其真实浓度不同的任何基质成分,引起基质干扰的物质分子通常不得而知。

基质干扰通常称为非特异性。一个测试方法是被设计用于检测(detect)某个特定的待测物,基质中任何能够产生检测信号或者抑制待测物信号的组成成分都可以定义为非特异性干扰。

然而,在对测试方法和待测物的生物学进行详细评估之后,通常所观察到的干扰并不令人惊讶,并且是由一个确定的生物分子引起的。因此,生物分析必须严格地审视现有的文献以及之前的研究成果和试剂的特异性,以便相应地确定该测试方法的特异性(specificity)。通常,干扰(Interference)和特异性是相关的, 一个拥有绝对特异性的测试方法不应受到任何基质干扰的影响。

但是,生物基质较为复杂。即便对测试方法的系统和待测物的生物学有深度理解,也并不总是足以防止干扰的发生。与很少只检测到单一条带的western blots方法相似,大多数免疫测试方法(immunoassays)的特异性并不总是只针对一个待测物(图1举例说明了不同类型的干扰)。此外,干扰物质的分子性质是未知的,减少干扰最常用的方法是样本稀释。这种方法被广泛地使用,以致于大多数分析科学家倾向于稀释所有的样本,而不相信未稀释样本的检测结果。

一类值得特别注意的干扰物质是样本中的抗体。Heterophilic抗体一般具有广泛的反应性、低亲和力、能交联(crosslink)捕获和检测抗体,容易导致错误的高信号结果。人抗动物抗体被认为具有较高的亲和力,由于许多测试试剂含有来自小鼠的单克隆抗体,因此,人抗小鼠抗体是特别相关的一类干扰物质。

当今临床上使用的测试方法仍然在某种程度上对heterophilic敏感,临床医生应该考虑相关策略,以应对免疫测试得出的不正确结果所造成的潜在损害。类风湿因子(rheumatoid factor),即针对人类IgG的Fc区域的人类抗体,具有类似的效果,可以阻断待测物与试剂的结合或交联测试试剂,特别是当试剂是人源的时候(例如,用抗体药物作为测试试剂进行ADA检测)。

干扰也可以来自于待测物或测试试剂的变化甚至降解,从而导致检测信号的降低。当测试试剂可以结合到微孔板的表面或其它测试平台上类似的表面的时候,会不真实地增加测试信号。最后,当样本的采集或处理过程引入了不反映所涉及生物体液中待测物浓度的额外待测物时,待测物本身也就产生干扰(见图1)。同样,非常高浓度的待测物可以通过所谓的钩状效应抑制测试信号。

图1.免疫测试中的基质干扰;HAMA:人抗鼠抗体; int.:干扰分子; RF:类风湿因子



3.在方法开发和样本分析中基质干扰的表现

在支持临床前和临床研究的LBA方法中,可以在检测研究样本之前评估大多数的干扰。这种评估和减轻干扰的过程是定量分析方法开发的一个重要组成部分,通常可以通过一些简单的实验来揭示干扰的存在。

平行性/线性和加标样品的回收率

通常可以通过测试样品的连续稀释来揭示干扰的存在。对不同程度的样本稀释,干扰很可能会导致所测定的浓度(dilution-adjusted concentration)的变化或不同。在大多数测试中,这种并行性的缺乏通常在较高的稀释倍数下会消失,表明干扰是由一个基质组分引起的。因此,如果在高浓度的情况下出现不平行性,干扰很可能是由于高浓度的干扰性基质成分,能够以高亲和力结合待测物或测试试剂的基质成分,或标准参考(比)物与内源性待测物之间的差异引起的。

严格地说,后一种情况不是干扰,而是表明标准参考(比)物不适合用于定量内源性待测物。在这种情况下,测试方法只是准(半)定量的。当一定量的待测物加入到样品中时,不受干扰的分析方法应该能够对加入量进行定量(回收率=100% + 误差),基质干扰往往会导致外加待测物的回收率降低,即<100%。如果内源性待测物与添加的待测物的性质不同,如重组蛋白vs内源性蛋白,回收率本身只能作为干扰的一个指示。<>

阻断干扰和特异性的相互作用

如果测试信号在添加阻断试剂(例如阻断缓冲液/ blocking buffers或heterophile阻断试剂)后发生变化,则可能存在因测试试剂之间的相互作用或固体载体引起的基质干扰。阻断试剂与稀释研究已被用于筛查干扰的类型,使用特异性试剂阻断待测物可能会揭示非特异性信号,因为特异性阻断试剂应该使得特异性信号的完全丧失。如果测试信号或一部分信号在使用阻断试剂后仍然存在,这就意味着存在干扰。

研究结果评估

即使经过严谨的分析方法开发,测试研究样本时也会出现干扰,有时是因抗体药物或联合用药导致的基质变化所引起的。出现干扰的指示是测试结果与给药后的预期效果不一致,特别是在研究的过程中,比较个体的PK,PD和免疫原性数据时。相关的检测结果不一致也是存在干扰的一个重要指示,然而关于研究结果是否有效的结论则应该谨慎,出乎预料的结果很有可能也是有效的。

下一节将讨论在可溶性蛋白生物标志物,抗体药物和ADA测试中观察到的干扰。

4.可溶性蛋白生物标记物

可溶性蛋白生物标记物的定量分析已成为药物开发的基石,并为药物开发过程中的安全性、有效性、PD和作用机制的评估提供重要信息。血液循环或尿液中的可溶性蛋白质样本很容易获得,在临床上作为常规的诊断性测试(diagnostic assays)使用,或用于预测患者对药物的反应。在这个领域中,诊断测试中存在干扰是公认的,因此完全依赖某一个测试结果可能导致误诊。

一个明显的例子是在诊断性人绒毛膜促性腺激素检测(diagnostic human chorionic gonadotropin assay)中,最可能由heterophilic抗体干扰引起的假阳性结果导致了不必要的,包括外科手术和化疗的治疗性干预。用于支持测试方法开发的研究的聚焦点(focus)和深度(depth),取决于该方法的预期目的,因而出现“符合其用途(fit-for-purpose)的方法开发”这个术语。

关于生物标志物的分析方法开发和验证,通用指南的发布极大地推进了生物标志物检测的方法开发和验证的实践。本文关注的焦点在于测试方法对测试结果的干扰。

样本采集和处理

从血细胞中非特异性地释放待测物可能发生在涉及血液基质的样品采集或处理过程中,如果可溶性蛋白生物标志物出现这种情况,就会导致待测物浓度的假性升高以及测试结果的变异性增加。例如,在测定PDGF或VEGF等生长因子时,应注意选择最合适的样本类型,以避免样本的处理过程非特异性地激活血小板并释放蛋白质进入到样本中。对于这些待测物,血浆是比血清更合适的样本基质。

有研究表明,在分析前样本的处理过程中,室温保存会显著改变血液样本中IL-8的浓度。室温孵育会产生更多的IL-8,导致血液裂解液(blood lysate)样本中IL-8的浓度不真实地增加。采集后立即将样品保存在冰上,而不是室温下,可以减少这种影响。红细胞部分溶解(溶血hemolysis)的血清或血浆样本并不少见,如果红细胞含有高浓度的待测物的话(例如,aspartate transaminase),则会导致待测物的错误数值。

蛋白质的构象可以影响检测试剂的检测能力,这可能由测试缓冲液中的成分引起。例如,血浆中钙的螯合作用已被证明会影响对钙结合蛋白S100A12的检测。这样的干扰可以通过使用不依赖于阳离子结合而能检测待测物的检测试剂,或在样本中加入阳离子,或选择不引起金属螯合的样本制备方法(例如肝素钠血浆或血清)来减轻。

在某些情况下,样本的物理特性会使移液变得困难,这种情况或将在测试过程中引入干扰。例如,痰的粘度很高,以至于不能实现精确的移液。通过对常规的痰液采用黏液溶解剂dithiothreitol处理,可以降低总粘度;同时,还必须考虑dithiothreitol的浓度及其对免疫测试试剂和待测物完整性的潜在影响。

此外,一些血浆或尿液样本中不溶性沉淀物引起的高浑浊度会引入干扰或高背景信号,可以通过离心或过滤来减少沉淀物,诸如此类的方法可以减少基质干扰,并尽量减少由机械性错误引起的误差。

特异性

如上所述,对分析方法特异性的错误解释是基质干扰的主要原因。一个可溶性蛋白生物标志物可能有不同的高度同源的家族成员,异构体或前体蛋白(precursor proteins)。如果一个结构上与实际待测物相关的蛋白质,而且免疫分析系统中的捕获试剂和检测试剂都能识别,那它就会导致可溶性蛋白生物标志物出现错误的高浓度结果(例如,一种商用的PDGF-BB测试方法也检测到10%的PDGF-AB)。

Periostin是嗜酸性气道炎症的生物标志物,具有多种亚型;在分析方法的开发过程中,明确定义了该方法对于这些异构体的特异性。一些用于medullary thyroid carcinoma诊断的calcitonin分析方法,似乎也部分检测到了pro-calcitonin,但后者对于medullary thyroid carcinoma没有诊断价值。

如果只有捕获试剂(或均相分析中的检测试剂)与待测物相关的蛋白质结合,则可能导致待测物的错误的低测定值。可以通过了解相关生物系统来理解和管理这样的干扰。例如:确定潜在的交叉反应因子及其相对浓度和亲和性、选择对待测物尽可能特异性的试剂、稀释样品(其可能将相关干扰蛋白的浓度降低到测试方法的检出限以下)。

另一种可能的方法是通过添加一种特定的试剂来消耗或中和系统中的干扰异构体或家族成员蛋白,这种试剂只压制(suppression)相关蛋白,而不压制待测物本身。

结合蛋白

可溶性受体或其它直接与待测物结合的蛋白质的存在可能导致分析信号的改变,因为它们可能在LBA测试中,阻断或加强与捕获或检测试剂的相互作用。例如,IL-6可与IL-6R和gp130形成复合物,可根据检测试剂的不同,可以检测到不同性质的IL-6。通过选择测试试剂,其结合待测物,但不与样本中干扰蛋白竞争结合位点,则可以减少可溶性受体或结合蛋白引起的干扰,特别是当引起干扰的相互作用的亲和力低时,稀释可以减少干扰。如果不可行,其他可能的方法涉及破坏待测物和结合蛋白或可溶性受体之间的结合。例如,酸解离可以从类胰岛素生长因子与其结合蛋白的复合物中解离出类胰岛素生长因子,在中和样本之前加入结合蛋白的抑制剂可以进一步减少干扰。

对此类样本预处理,应严格评估其对测试试剂或待测物表位的影响。由于此类基质干扰可能难以完全消除,因此,最重要的是了解测试试剂的特异性以及检测到的待测物的各种复合物,以便据此解释测试结果。

内源性抗体

如前所述,heterophilic抗体和抗动物抗体可以结合主要是动物来源的抗体测试试剂;从而导致不真实的高或低结果。人抗小鼠抗体是最常见的人抗动物抗体类型,可以结合夹心式LBA方法中的捕获和/或检测试剂(取决于产生试剂的物种)。与这两种试剂结合会导致试剂桥接和特定待测物的假阳性结果;与其中的一种结合,则可能会破坏待测物的结合并导致假阴性结果。减少heterophilic抗体或人抗动物抗体干扰的最常见方法是添加动物免疫球蛋白(纯化或来自正常动物血清中的)或其他商用试剂(例如heterophile的阻断剂),这些试剂对heterophilic抗体具有特异的活性。

此外,对蛋白质生物标记的抗体(自体抗体autoantibodies)可能导致错误的低或高信号。例如,针对thyroxine的自体抗体,存在于Hashimoto’s thyroiditis等疾病中,并在一个thyroxine竞争性免疫测试方法中与fluorescein-T4示踪剂结合,导致thyroxine测定值偏低。

均相的测定方法(homogenous assays)可能比sequential assays更容易受到这种干扰。选择来自两个不同物种的试剂来捕获和检测待测物,也可能有助于减少人抗动物抗体的桥接干扰。另一种方法是对样本进行足够的稀释以消除干扰。使用G蛋白去除干扰抗体,或使用detergent破坏嗜异性抗体的相互作用。这些和其它改变样本的处理可能会产生问题,因为它们可能会意外地移除待测物或影响测试试剂。

其它样品成分

历史上,测定吸光度或光散射的临床测试方法受高脂(脂血症lipidemia)或胆红素(黄疸icterus)样本的影响,而LBA方法则不受影响。然而,胆红素降低了一个检测b型人绒毛膜促性腺激素和IgG的商业化的检测方法所测定的数值,干扰可能来自预料之外的地方。

例如,胰腺囊肿液中的蛋白酶可以降解待测物和试剂抗体,蛋白酶也被怀疑干扰了痰标本中IL-5的检测,因为添加蛋白酶抑制剂增加了IL-5的检测数值。有趣的是,在使用治疗剂量后,发现样本中的biotin对几个测试方法产生了巨量干扰。


5.游离的可溶性靶标&可溶性靶标总量分析

游离和总体靶标分析是针对可溶性抗原抗体药物最常用的靶标结合生物标志物。如果一个靶标的可溶性形式进入血液,或者膜结合靶标的可溶性异构体可能存在于血液循环中,则游离和总体靶标分析数据也可作为针对膜抗原抗体的替代靶标结合生物标志物。

抗体药物对游离的靶标的压制(suppression)是衡量靶标结合效的直接表现。使用抗体药物治疗后,由于与抗体药物结合后靶标清除率降低,总体靶标通常在血液循环系统中累积。由于靶标结合与其清除率之间的这种关系,靶标总数间接地说明了靶标的结合程度。此外,从总体靶标累积的数据,可以通过PK/PD模拟对游离靶标的压制。定量分析游离和总体靶标,除了面临所有对可溶性蛋白生物标志物的挑战外,还面临独特的挑战。

关键术语

游离可溶性靶标的定量方法:衡量靶标参与度的测试方法。由于游离的药物和与药物靶标结合的药物之间的动态平衡在样本孵育过程中发生变化,这种测定方法尤其受到检测程序本身的干扰。

游离可溶性靶标的分析方法

大多数测定游离可溶性靶点的方法都是基于捕获试剂与抗体药物竞争与靶点结合的原理。测试方法的特异性和对靶标生物学的理解是建立可靠的游离靶标分析方法的关键。预期对这类方法的干扰与先前讨论的生物标志物方法相同。此外,游离靶标的定量还会受到与方法的特异性,样本稀释,抗体药物/靶标复合物的无意解离、孵育时间和捕获试剂的浓度相关的干扰。

对游离靶标的定量分析中,靶标可能不仅与抗体药物结合,而且还与内源的可溶性受体或结合蛋白相互作用。在某些情况下,它们与靶标结合的亲和力与抗体药物相当。此外,靶标蛋白的不同亚型不一定与抗体药物结合,因而不一定被被检测到。

确认一个方法能检测到的靶标组分(fraction of target)是至关重要的。它既可以是未结合抗体药物的组分(therapeutic antibody-unbound fraction),也可以是未结合抗体药物和结合蛋白的组分(the binding protein- and therapeutic antibody-unbound fraction)。在这两种情况下,可能有必要在研究期间评估结合蛋白水平的变化,以适当地解释数据。此外,了解结合蛋白是否抑制靶标蛋白以及结合蛋白是否与药物抗体竞争与靶标蛋白的结合,也是至关重要的,由于一些靶标拥有多个结合蛋白,因此应该将体外结合实验的重点放在对游离靶标结果有影响的结合蛋白上。

许多LBA方法依靠稀释样本来减少未知来源的基质干扰。在游离靶标的分析中,稀释样本改变了游离靶标与药物结合的靶标以及与血液循环中结合蛋白或可溶性受体结合的靶标之间的动态平衡。此问题有两种解决方案:1.开发不需要稀释样本的分析方法; 2.稀释样本并恰当地报告结果。如果可行,始终优先考虑在未稀释的样本中定量分析游离的靶标。

在未稀释的样本中消除基质干扰是一项困难的工作,因为生物基质是复杂的,并且在血浆和血清中总蛋白浓度很高。测量未稀释样本的一种方法是使用与样本基质相似的缓冲液制备标准曲线,这将导致对标准曲线和样本相同的基质效应,因此测试结果不会受基质的影响。这个方法只有在单个样本之间的基质干扰相对稳定的情况下才会有效,生成这种测试基质最准确的方法是将所有待测物消耗掉,并避免depleting reagent进入样本基质。使用来自其它物种的血清或血浆(例如,胎牛血清)通常是足够的,因为它们不与捕获试剂结合,或者在均相分析中也不与检测试剂结合。从操作的角度来看,未稀释的血清或血浆样品是粘稠的,在移液和稀释过程中需要格外小心,以确保测试的准确度和精密度。

从稀释的样本中准确地得出游离待测物的浓度也具有一定的可能性。在一个双组分系统中,抗体药物和亲和力与丰度是已知的,因此可以预估对稀释样本中待测物浓度的影响。对于平衡扰动对测定游离激素的影响有详细的研究。图2显示了一个简单的、在不同的靶标/抗体药物比值下样本稀释的模拟。对于亲和力为0.1nM的典型抗体,靶标浓度为5 nM,对于靶标/抗体药物结合位点(CDR互补性确定区域)比例为1:3或更高的情况,未经稀释调整的浓度是相当准确的。对于CDR与靶标浓度比值较高的样本,较高的稀释度对未调整稀释的浓度(non-dilution-adjusted concentration)的影响不大。也可以通过模拟不同体内情况下的体外实验来验证数据报告的策略。对于在药物wash-out period结束时收集的样本,即当抗体药物和靶标浓度趋于一致时,报告未稀释调整的数据将是不准确。在上面的例子中,当CDR与靶标的摩尔比值为1:1时,未经稀释调整的数据是不准确的。在相关研究中,必须定义一个客观标准,只在合适的时间点报告未经稀释调整的浓度数据。

图2. 在不同靶标-抗体浓度比值下,样本稀释对游离靶标的浓度的影响。假设:解离常数(KD)= 0.1 nM;样本中的待测物浓度为5 nM;抗体药物的CDR是1-,3-,10-,30-或100-倍于靶标的摩尔浓度

此外,测试试剂会引入一个误差,因为结合的和游离的靶标之间的动态平衡会发生漂移(当存在额外的结合试剂,即捕获试剂的时候)。这种所谓的观察者效应(observer effect)解释了一个物理原理:观察的行为会改变被观察的现象。

虽然这一原理与可溶性蛋白生物标志物的定量分析几乎无关;然而,这一原理却非常适用于游离靶标的定量分析,在总体靶标浓度高、游离靶标浓度低的样本中体现得尤其如此。在抗体药物给药后,由于与抗体结合后靶标的系统清除率降低,总体靶标常在血液循环系统中累积。

对游离靶标最佳的定量分析方法应该使用最少量的捕获试剂和较短的孵育时间,以最小化对平衡的干扰。然而,这种方法降低了测试方法的精密度、稳健性和线性范围。因此,最好研究观察者效应的程度,并在游离靶标分析的准确度和实用性之间找到一个平衡。

如果捕获试剂与抗体药物相同或非常相似,ADA就会干扰游离靶标的定量。在这种情况下,ADA不仅与抗体药物结合,而且还结合并阻断捕获试剂,因此很少或没有游离靶标能与捕获试剂结合,导致游离靶标的浓度大幅降低。这一效应可能导致即使在没有抗体药物的情况下,靶标也被压制的假象,有鉴于此,应当避免将抗体药物作为捕获试剂使用。

在药物开发早期,可能没有合适的试剂。如果抗体药物的免疫原性非常低,或者是单剂量给药的研究,在免疫系统开始产生ADA之前抗体药物就被清除了,则可以将抗体药物作为捕获试剂。亦可将ADA为阳性的个人的游离靶标数据排除在最终的数据分析之外。此外,在临床前研究中,可以从样本中剔除包括潜在的ADA在内的动物抗体。

可溶性靶标总量的分析方法

抗体药物经常干扰可溶性靶标总量的测定。即使捕获和检测抗体的表位与抗体药物的表位都不重叠,仍然经常会出现干扰。抗体药物可能改变靶标的构象或与两个靶标分子交联(crosslink),导致靶标总量的高估或低估。为了规避这一效应,可以在样本中加入过量的抗体药物,将所有游离的可溶性靶标转化为药物-靶标复合物。添加过量的抗体药物后,就可以使用针对靶标-药物复合物的定量分析系统来测定靶标总量。在这种情况下,ADA可能结合抗体药物造成干扰,可通过形成多聚体复合物(multimeric complexes)来阻断检测(inhibit detection)或放大特定的检测信号。

Salimi-Moosavi等人证明,研究样本的碱性或酸性/guanidine 处理均可将抗体药物产生不可逆变性,而靶标在样本中和后,则可恢复免疫反应性。这样的预处理能有效地消除抗体药物的所有干扰(这种方法能广泛应用于其他蛋白靶标和抗体药物,那将会很有意义)。

另一种方法是将仅使用一种非竞争性抗体和治疗性抗体作为试剂,使用非竞争性抗体捕获靶点游离或结合在治疗性抗体上。靶标和治疗性抗体,然后筛选了酸、中和和涂布到聚苯乙烯板上。进而用标记的治疗性抗体检测被包裹的靶点。

特别声明

本文如有疏漏和误读相关指南和数据的地方,请读者评论和指正。所有引用的原始信息和资料均来自已经发表学术期刊, 官方网络报道, 等公开渠道, 不涉及任何保密信息。参考文献的选择考虑到多样化但也不可能完备。欢迎读者提供有价值的文献及其评估。

扩展阅读







参 考 文 献

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