上周，“袁来如此”专栏就LBA定量方法的监管验证展开了第一期详细介绍，围绕历史视角、文件记录要求、测试试剂的选择、稳定性、测试格式和运行/批次大小（batch/run size)、参照（比）物（REFERENCE MATERIAL)特异性（specificity)和选择性（selectivity）等方面的内容进行分享，本期将延续上期内容，继续分享后续相关内容。
样本基质的选择、样本制备和最低稀释倍数（MINIMUM REQUIRED DILUTION,MRD）选择基质时的考虑因素，是小分子开发的分析方法与为大分子药物开发LBA定量分析方法之间的关键区别之一。小分子分析方法通常包括一个分析前的萃取步骤，该样本前处理步骤通常有助于减轻单个基质的变异性所带来的问题。
而蛋白待测物的固有特性使得在样本分析之前做萃取很难，通常是完全无法萃取。因此，通常所开发大分子定量方法无需萃取，即可测定复杂生物基质中的待测物。然而，在可能存在内源性蛋白待测物的情况下，必须仔细地考虑基质的选择和数据分析。
方法开发阶段
所收集的生物样品中的待测物存在于不同的基质中，包括血浆、血清、尿液、脑脊液（CSF）、关节滑液和均质化的组织。由于待测物的特性会受到样本制备方法影响，因此必须在样本采集过程中评估如下因素：所需要的任何添加剂（抗凝剂、蛋白酶抑制剂等）、待测物的稳定性（血浆或血清分离前的全血）、样本收集后的处理和储存条件（温度、瓶型等）。测试格式、样本收集条件和其他因素可能会影响基质的选择，例如如果使用自动化样本处理系统，则血清将是首选的基质，因为血浆中通常含有血纤维蛋白凝块，可能会干扰移液操作。相比之下，血浆是不稳定待测物的首选基质，因为制备血清所需的时间较长，而且存在蛋白水解酶（proteolytic enzyme）降解蛋白的问题。本文稍后将对样本收集后基质中的待测物进行更确切的稳定性评估。加标样品（spiked sample）的基质应当与预期的未知研究样本的基质相同，要使用相同的基质制备标准品（标/校准品，standard/calibrator）。当在基质中检测不到内源性信号时，简单地加标/回收研究就足以确定合适的空白基质。在这些条件下，建议使用标称浓度（nominal concentration）。相反，当基质中存在可定量的内源性物质，并且内源性物质和外加待测物的回收率是累加式（线性）的时候，可以应用一个校正因子（例如内源性浓度4ng/mL，加标分析物为6ng/mL，累加效应为10ng/mL）。在这种情况下，可将所测定的内源性浓度与所添加的待测物浓度（标称值）相加来得到指定值（assigned value）（表IIA和表IIB）。表IIA.内源性蛋白累加贡献效应的示例。在这种情况下，内源性蛋白的影响可以在低质量对照样品（QC）中观察到；但其对中、高水平质量对照样品的影响不大。
表IIB. 当等体积的基质和QC加在一起时，内源性蛋白累加（线性）贡献的示例。方法：50mL含内源性药物的基质（25.7U/L）+ 50mL 标准品10（10U/L）= 期望值17.9U/L（相互以1：2的比例稀释：12.85U/L+ 5U/L= 17.85U/L）
另一种选择是减去内源性浓度，该浓度是用正在验证的分析方法或一个正交的（orthogonal）分析方法所测定的。这种方法需要分析空白样品（另外加待测物），这样就可以减去内源量，并计算出外加的标称量。当内源性浓度和外加的待测物浓度不是线性关系时，就不能用数学方法将这两个浓度相加，因而只能报告测定的（观察到的）浓度（表IIC）。或者可以在外加待测物之前，剥离空白基质中内源性蛋白。
表IIC. 内源性蛋白非线性贡献的例子。观察到的药物浓度与“空白”基质中的内源药物量或外加的“目标”浓度均不是线性相关。在这种情况下，观察到（测定）的浓度是唯一可以放心使用的数值。
通常不推荐使用剥离了内源物的基质或替代基质，但在无法设计其它策略来定量内源物时，则是必要的。使用木碳（charcoal）剥离的基质，很难保证基质的其它方面不发生变化。如果使用配体亲和层析剥离内源物，配体的溶出可能会干扰该分析方法。无论基质干扰的来源如何，制备QC样品时，必须使用与研究样本类型一致的、纯粹且未改变的基质。除了保证待测物的稳定性外，在纯粹基质（neat matrix）中制备QC样品还可用于同时测定分析方法的精密度和准确性。
当难以获得生物基质（例如关节滑液、脑脊液）时，可以用一个替代基质（substitute matrix）来制备标准曲线。应尝试使用真实样本基质制备至少一个级别的QC样品，以证实基质效应没有影响准确度，即没有均值偏差（mean bias）。分析方法所需的最小稀释倍数（MRD）是必须稀释样本的最小稀释倍数，是为了在分析时使用规定的标准品和样本稀释液，以达到最优的准确度和精密度。在某些情况下，如当标准品是在100%的血清或血浆中制备时，则不存在MRD，可以直接分析未稀释的纯粹样本。在其它情况下，如果内源性物质没有产生线性信号或观察到的背景信号不是由于内源性的分析物（例如，heterophilic antibodies，风湿因子）增加影响的，则可能需要稀释样本，以建立可接受的线性关系。为了克服信噪比的问题，所有的样本都必须以某个倍数进行最低限度的稀释，以取得更高的重现性和准确度。研究前验证阶段
在方法开发过程中所选择的生物基质将用于制备研究前验证所用的标准品和验证样品。一旦在方法开发过程中解决了基质的影响，就不需要进一步的验证，但验证报告中应该包括对该解决方法的讨论。如果使用的是经过剥离的基质，验证样品则必须在同样的基质中制备，以评估精密度和准确性。在方法开发过程中选择的MRD也将在研究前验证中得到确认。研究中验证阶段
在研究中验证时，除了在观察到基质干扰时需要额外稀释样本外，没有与样本制备相关的接受标准。由于潜在的基质干扰而导致重新分析样品时，应当预先设定并常规地应用相关指导原则。在基质批次变化的情况下，应当制备相同浓度的QC样品，证实与研究前验证数据的可比性，然后继续进行样本分析。标准校准物（STANDARD CALIBARTOR)和标准曲线将已知数量表征良好的标准参照（比）物（待测物，analyte）加入到适当的基质中制备标准校准品，在既定的分析条件下生成并得到浓度-响应关系，即标（校）准曲线（standard curve）。根据这个标（校）准曲线，未知样品中分析物的浓度可以通过内插方法计算。在方法开发过程中，应当建立标准品的浓度和将一条曲线拟合于校准数据的回归模型，此模型需在研究前验证期间得到确认，并在分析研究样本时使用。表III汇总了评估标准曲线数据设计和分析回归模型的建议，将使用表IV中的研究前验证的标准曲线数据说明统计分析的过程。表III. 标准曲线评定标准. （未包括“锚定点”）
表IV.一个研究前验证的标准曲线响应值
方法开发阶段
由于标准点浓度在方法验证开始后不应改变，因此在方法开发过程中应包括更多的标准点（standard point）和重复点（replicates），以便尽早地详细研究浓度-响应关系，尽可能地实现为回归模型提供可靠的评估。标准参照（比）物浓度点的范围应包括稀释后研究样品的浓度，并在对数刻度上近似均匀地间隔。建议至少有10个非零标准浓度点（复孔，duplicate）用于浓度-响应关系，用于其早期特征的描述。该浓度-响应关系可以使用4/5参数的logistic函数（4/5PL 模型）来描述。图1. A.5参数logistic (5PL)加权非线性最小二乘法回归拟合的曲线。平均响应是表IV.中列出了第6个运行（batch）的重复结果。B.图1A中回算标准点浓度的百分比相对误差。所有数值都在标称值的10%以内。
拟合曲线时，对平均响应值是否加权的问题，应通过对复孔数值的标准方差与不同浓度点的平均值之间的关系来评估决定。例如，表IV中标准校准点浓度的混合标准方差与平均响应的关系图在对数刻度上显示了一个线性增加的关系（图2）。在这种情况下，加权拟合通常比不加权更合适。在考虑删除复孔值的标准时，有关复孔值变异性的信息会非常有用。
图2. 表IV所列标准曲线吸光度值的混合运行（batch）内标准方差与累积平均响应之间的关系。每个点代表一个浓度点的平均值和通过方差分析（ANOVA）计算的标准方差。在高吸光度水平下，变异性较大；这表明，在拟合标准曲线时，加权可能是适当的。
在建立校准模型时，建议分析至少3个独立运行（batch/run）的标准曲线浓度-响应数据，每次运行应包含两条标准曲线，以便评估运行内标准曲线的可重复性。模型的适宜性取决于标准点回算浓度的RE，计算一个浓度点的RE如下：从回算浓度中减去标称浓度并将其差值除以标称浓度。通常，对于曲线内的大多数标准点回算浓度的绝对RE应为20%。例如，根据加权5PL回归曲线拟合平均光吸收值（表IV中第6个运行的数据）所得出的模型，回算浓度的绝对REs都是<10%（表V和图1B）。同样，其他5个运行的绝对REs也始终一致地<10%（第1个运行中的几个点除外）。
表 V. 对于表IV中数据的平均响应，回算的标准浓度的百分比相对误差 (%RE)
一个可被接受的校准模型，其曲线的累积回算数值对于在预期的定量范围内的所有浓度，应具有10%的绝对平均RE值和15%的变异系数（CV）（参见表V）。在校准品浓度范围中，如果平均RE存在一个趋势，即回算浓度始终一致地高于或低于标称浓度，则是拟合失败的证据，会使该模型失效。拟合失败可能是由于选择了不合适的平均值函数（例如，在浓度-响应曲线不对称时使用了4PL函数）或加权过程不当。例如，加权使得拟合的曲线与表IV中的数据更相符，其证据是：在较低浓度部分，降低了平均RE(图3A)和CV(图3B)；而在较高浓度部分，准确性或精密度的损失极小。图3. A.未加权和加权五参数logistic(5PL)回归曲线回算浓度的累积平均相对误差百分比的比较与表IV的吸光度数据相吻合。加权模型的结果在整个标准浓度范围是可以接受的，而非加权模型在低于1000pg/mL浓度是不可接受的。B.未加权和加权五参数logistic (5PL)回归曲线回算浓度变化的累积百分比系数的比较与表IV的吸光度数据相吻合。加权回归模型的计算值总结如下在表V中。加权模型在较低浓度水平下得到了较小的批间变化系数。
表IV.一个研究前验证的标准曲线响应值
表 V. 对于表IV中数据的平均响应，回算的标准浓度的百分比相对误差 (%RE)
研究前验证阶段
对研究前验证所需的标准校准品，应根据方法开发过程中获得的性能信息来制备。通常，对于使用4/5PL函数来拟合的浓度-响应关系，在预期的浓度范围内，应至少包括6个非零、复孔校准点，这些校准点应在对数刻度上近似均匀地间隔。为了改善曲线拟合，可以包括定量范围之外的锚定点或校准点。
在方法开发过程中建立的回归模型应在至少6个独立的研究前验证运行中得到确认，通常也在相同的运行中评估方法的精密度和准确度。在一个运行中接受标准曲线时，回算浓度值（至少为75%，不包括锚定点和校准点）的%RE应在标称浓度的20% 以内（对于LLOQ，%RE应在25%以内）。验证结束时，应为每个校准点计算所有运行的累计平均%RE和%CV，如果每一个标准点（不包括锚定点）的RE和CV均为15%，则回归模型是可以接受的；在LLOQ，%RE和%CV应为20%。应当在报告验证样品的分析结果之前确认回归模型。由于可确定的原因造成了技术误差（如，移液误差），或可通过应用a priori统计标准编辑标准曲线，屏蔽某些校准点。
研究中验证阶段
对每个研究中的测试运行，应使用与研究前验证相同的标准，监测标准曲线和编辑标准曲线中某个校准点。标准曲线的编辑必须独立于QC，并于评估QC样品的性能之前完成。编辑后剩余的校准点的最终数量必须≥总校准点的75%；或者除锚定点外，至少有6个校准点。如果删除高（ULOQ）或低校准点（LLOQ）中的任何一个，这个运行的定量范围将被限制在下一个校准点，所以，必须重新分析超出定量范围的样本。本文如有疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有引用的原始信息和资料均来自已经发表学术期刊、官方网络报道等公开渠道, 不涉及任何保密信息。参考文献的选择考虑到多样化但也不可能完备，欢迎读者提供有价值的文献及其评估。
