上周，“袁来如此”专栏就药物开发过程中如何缓解或消除对LBA定量分析方法干扰的策略展开了详细介绍(袁来如此｜大分子生物分析概论（六）上：LBA定量抗体药物的背景干扰及其消除)，本期将延续上期内容，重点关注抗体生物药的定量分析。

“袁来如此”专栏系广州博济医药微信公众号打造的科普学术专栏，内容均为博济医药子公司深圳博瑞副总经理袁智博士原创。

LBA测试方法常用于定量生物基质中抗体药物的浓度，根据测试格式的不同，LBA可以测定游离药物的浓度或药物总量。游离药物是指不与靶点结合的治疗性抗体。药物总量则指游离的加上结合了靶标的药物。由于PK数据至关重要，相关监管指南和行业共识都对定量方法的验证提出了相关建议，包括应对干扰的一些方面。

游离的抗体药物的测定通常使用抗原或中和性抗独特型抗体(anti-ID)作为捕获抗体。检测抗体可以是中和性anti-ID、非中和性anti-ID、抗人IgG、抗人特定等型（specific isotype）抗体（如抗人IgG2特异性抗体）或抗药物抗体的框架突变（anti-framework mutations）的抗体。抗体药物总量可被非中和性anti-ID、抗人IgG、抗人特定等型（specific isotype）抗体或抗药物抗体的框架突变的抗体捕获和检测。但是，很少能得到非中和性anti-IDs，因为在大多数情况下，生产anti-IDs时会产生很多中和性anti-IDs，但非中和性anti-IDs的产生量却很少。

游离抗体药物的定量在技术上是具有挑战性的，特别是当可溶性靶标在样本中处于高水平时，许多基质成分可以显著改变可溶性靶标的水平或影响药物与可溶性靶标的结合，从而引起游离药物浓度的变化。此外，这些成分也很有可能对之前所讨论的可溶性靶标定量起到干扰。

在定量分析抗体-药物偶联物(ADCs)时，样本的制备具有特殊意义，因为ADCs可以在采集的样本中或体内发生生物转化，使本已复杂的ADC生物分析更加复杂化。

即使是单克隆抗体的定量也会受到样本制备方法的影响。例如，使用EDTA作为抗凝剂会螯合阳离子（如Ca2+和Mg2+），从而影响游离抗体药物浓度的准确测定，如果这些阳离子是药物与靶标结合所必需的。

在样本收集和制备过程中，不理想的程序（如上半篇提到的生物标志物部分所讨论的）会从细胞中释放可溶性靶标，导致样本中靶标的浓度人为地升高，从而低估了游离抗体的浓度。

为了减少这些潜在的干扰，在对每个抗体药物进行分析时，都应该优化样本采集程序和检测条件。正如前文所提到的，制备血清的过程可释放储存在血小板中的蛋白质，而使用血浆则可避免它的释放。此外，可以实施样本增稳的条件，如低温，可以减少在样本收集过程中蛋白质从细胞中释放出来的量。在检测试剂存在的情况下先进行样本酸解处理，再进行中和处理，或在检测过程中保持样本的弱酸性，该方法已被证明可以有效地减少来自靶标的干扰。

对于游离抗体药物的分析，应该优化检测条件，如孵育时间、捕获试剂的浓度和最低稀释要求，以最大限度地减少药物从它的靶标解离。这对与其靶标亲和力较低、在血液循环中可溶性靶标浓度较高的抗体药物，尤为重要。因此，需要在研究人群中评估稀释线性度和样本稳定性，以将靶标水平的变化对游离药物定量的准确性这一影响纳入考虑。

当使用抗原捕获待测物时，高浓度的结合蛋白或可溶性受体（soluble receptor）可能会饱和捕获试剂，致使游离药物的浓度被低估。使用中和性anti-ID，而不是药物靶标，作为捕获试剂，则可以最大限度的减少这个问题。

样本中的ADA是基质干扰的一个来源。ADA与捕获抗体（或在均相测试方法中的检测抗体），结合到抗体药物上，这一竞争会低估抗体药物的浓度；非竞争性ADA可使抗体药物分子交联形成大体量的复合物，这也会影响药物浓度测定的准确性。通过对PK、PD和ADA的结果进行比较，可以验证研究中是否存在这种干扰，从而相应地解释相关数据。

与生物标记物测定相似，基质中的heterophilic抗体和人抗动物抗体是免疫测试中的常见干扰来源，可以用前述相同的方法来减轻干扰的影响。如果使用抗人抗体作为捕获或检测试剂，人体基质中的人体免疫球蛋白可导致显著的背景信号，可以选择使用Isotype-specific anti-human antibody替代pan anti-human antibody，以减少干扰。

生物药和完全的人源抗体药都有可能产生ADA（也称为抗药物抗体），会导致药物暴露量的损失、药效损失和严重的不良反应。免疫原性评估是临床研究中安全性评估的重要组成部分，ADA通常采用分级方法进行检测（筛查）、确认和表征。ADA测定是半定量的，因为这些测试方法缺乏标准曲线。阳性的定义是在测试切点以上的检测信号，由未接受药物的阴性样本的统计分析确定。

针对抗体药ADA的测定也主要是通过LBA方法进行的。大多数ADA免疫分析采用桥接测试格式，即ADA桥接（bridge）/交联（crosslink）两个药物分子结合。对抗体药中使用较少的另一种方法是直接结合免疫测试（direct binding immunoassays），其中抗体药是捕获试剂，检测试剂则是检测ADA的Fc部分。

在ADA检测中最常见的干扰是抗体药本身，样本中的药物与ADA结合，防止ADA与测试试剂形成复合物，在药物存在的情况下检测到ADA的能力，称为药物耐药性。

在临床和非临床ADA试验方法验证过程中，监管机构会要求评估和排除这样的干扰，可以通过在药物浓度预期较低的时间点（drug wash-out phase）收集样本进行ADA测试来缓解药物干扰。在某些情况下，通过酸分离可以提高药物耐受性。

使用高灵敏度的分析方法和稀释样本是提高耐药性的有效方法，用药物捕获ADA并通过Fc区域检测ADA的直接结合式LBA方法可能较少受到药物干扰，在这种方法中，只要ADA的一端可与药物捕获结合，就能检测到ADA。

桥接的测试格式则要求ADA的两端结合到测试试剂，Wu等人描述了一个直接结合式，以检测药物特异性的ADAs（IgE等型），并通过萃取抗体量总量，进而检测copurified 药物来定量ADA，这样可以完全消除药物干扰。Neubert等人通过protein G extraction，然后使用LC-MS检测copurified药物，证明了此方法的可行性。表1 列举了一些用于破坏ADA-药物复合物，以提高ADA检测灵敏度的方法（详见扩展阅读#2）。限于篇幅，本文不详细逐一讨论，请参阅本文末的参考文献。

样本基质中的药物靶标也可能干扰ADA检测，导致假阳性或阴性结果，桥接捕获和检测试剂的multimeric可溶性靶标能够产生假阳性结果。有报道称，在ADA测试中，含有CD20的细胞膜片段会对atumumab产生基质干扰，阴性结果可能是由于可溶性靶标与捕获和/或检测抗体结合，从而阻断中和性ADA的检测。下面的样本预处理，即用阻断性抗体结合靶标，或用结合蛋白对靶标进行阻断以及免疫消耗靶标，都可以消除这种干扰。例如，在针对ranibizumab的ADA方法开发过程中得到了证实。

虽然，大多数学者认为未使用生物药的个人不会有ADA，但有时在给药前就会检测到先前存在的抗体。值得一提的是，先前存在的抗体并不是干扰，且可能结合到抗体药物的任何地方。例如，检测到并确认了对panitumumab的中和性ADA，但报道说这些交叉反应性抗体并未改变药物PK或其安全性。

尽管如此，先前的ADA总是使得测试和结果解释变得更复杂。滴度和特异性测试有助于了解先前存在的抗体对给药后ADA发生率的贡献，针对cetuximab的先前存在的抗体有临床相关性，即先前存在的IgE抗体与严重的超敏反应有关。当一个抗体药物含有某个天然蛋白的免疫原性结构域而且大多数人以前可能接触到该结构域时，就很可能会有预先存在的ADAs。在recombinant therapeutic immunotoxins，即anti-CD3-diptheria toxin 和anti-CD22 Pseudomonas exotoxin A的临床研究中，就观察到先前存在的ADA。

表1. 用于破坏ADA-药物复合物，以提高ADA检测灵敏度的方法

在类风湿关节炎患者中较为常见的类风湿因子(rheumatoid factor，RF)，它是针对IgG的Fc区域的抗体，主要为IgM等型抗体。RF的结合亲和力低，预期不会在ADA测试中产生阳性信号，然而工程改造过的抗体药物可能对RF有更高的亲和力，从而可能在ADA检测中产生阳性信号。Araujo等人证明，在给药前的样本中，RF产生了阳性信号，而使用抗人IgM抗体的样本预处理会减少RF的作用。这种方法可能会影响IgM等型的ADA检测，作者筛查了含有和不含有抗IgM抗体的样本，并监测药物治疗期间滴度的增加。

可溶性蛋白生物标志物、治疗性抗体和ADA的生物分析是药物开发中不可分割的一部分，每一种分析物都有其自身的挑战。避免基质干扰最有效的方法是对靶标生物学和待测物本身具有扎实的理论基础，并着重关注测试/分析方法的特异性。

分析技术也可能在防止或减轻测试干扰方面发挥重要作用。在很多情况下，稀释是减少干扰的有效工具，而最高的稀释倍数受到检测灵敏度的限制。高灵敏度的分析平台在高稀释条件下，可以提供有效的工具，以尽量减少来自基质的干扰，分离和纯化技术的改进可以有效地将待测物从干扰因子中分离出来。例如，在ADA分析中，有效地从抗体药物-ADA复合物中定量分离出ADA就能解决其药物耐受性问题。

MS与LC结合已经成为一种强大的定量方法，并且越来越多的应用在蛋白药物 (尤其是抗体药物偶联物)和生物标志物的生物分析上。与LBA方法相比较，干扰对它的似乎不那么重要，因为MS是特异性很强的分析方法。虽然分析特异性在完全消除干扰方面会非常有帮助，但如果待测物在生物学上是完全等同的（identical），它也可能使生物分析变得极其复杂。

在许多情况下，MS能够检测许多不同待测物的混合物，而LBA方法只能检测一种待测物。因此，LC-MS/MS在生物分析中发挥越来越重要的作用。本系列后续文章将介绍大分子生物分析中LC-MS/MS方法。敬请关注。

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