日前，国家卫健委发布《医疗卫生机构开展研究者发起的临床研究管理办法（试行）》（以下简称《管理办法》），该《管理办法》将于2021年10月1日在北京市、上海市、广东省和海南省先行试点实施。 《管理办法》中明确医疗卫生机构开展临床研究，均应通过科学性审查和伦理审查，应充分尊重研究对象的知情权和自主选择权。根据临床研究的研究类型及潜在风险进行分类管理，加强对临床研究的全过程监管。有条件的医院，应考虑在同一部门下进行统一管理，建立专业的监督管理队伍。鼓励积极开展临床研究交流和培训，注重加强对研究者的培训和管理。 《管理办法》全文如下： 医疗卫生机构开展研究者发起的临床研究管理办法（试行）第一章 总则 第一条 为规范临床研究管理，提高临床研究质量，促进临床研究健康发展，提升医疗卫生机构诊断治疗、预防控制疾病的能力，根据《基本医疗卫生与健康促进法》《科学技术进步法》《执业医师法》《药品管理法》《医疗机构管理条例》《涉及人的生物医学研究伦理审查办法》等有关法律法规及部门规章，制定本办法。 第二条 医疗卫生机构开展的研究者发起的临床研究（以下简称临床研究）是指医疗卫生机构开展的，以人个体或群体（包括医疗健康信息）为研究对象，不以药品医疗器械（含体外诊断试剂）等产品注册为目的，研究疾病的诊断、治疗、康复、预后、病因、预防及健康维护等的活动。 本办法所称医疗卫生机构包括各级各类医疗机构、疾病预防控制机构、采供血机构、妇幼保健机构。 第三条 医疗卫生机构开展临床研究是为了探索医学科学规律、积累医学知识，不得以临床研究为名开展超范围的临床诊疗或群体性疾病预防控制活动。 所有临床研究均应通过科学性审查和伦理审查。 临床研究过程中，医疗卫生机构及其研究者要充分尊重研究对象的知情权与自主选择权。 第四条 医疗卫生机构及其研究者开展临床研究应当取得法律法规要求的临床资质，具备相应的能力和必要的资金保障。 第五条 医疗卫生机构是临床研究实施的责任主体，开展临床研究应当遵守有关法律法规、部门规章及有关规范性文件和技术准则、伦理规范的要求，制定切实有效的临床研究管理实施细则，建立健全保障科学、规范、有序开展临床研究的组织体系、质量体系、利益冲突防范机制和研究对象权益保护机制，加强对临床研究的质量保证和全过程管理。积极支持和组织开展临床研究学术交流和培训。 医疗卫生机构应当结合自身实际，合理判断临床研究的风险，结合研究类型、干预措施等对临床研究实行分类管理。 第六条 临床研究的主要研究者对临床研究的科学性、伦理合规性负责，应当加强对其他研究者的培训和管理，对研究对象履行恰当的关注义务并在必要时给予妥善处置。 临床研究的主要研究者和其他研究者应当遵守科研诚信。根据有关法律法规、部门规章、有关规范性文件、技术准则、伦理规范及医疗卫生机构制定的规章制度要求，加强对临床研究过程的自查，及时如实报告有关事项。 第七条 省级及以上卫生健康行政部门应当设立专家委员会或遴选有关专业机构，全面掌握并定期梳理辖区内医疗卫生机构开展临床研究情况，通过专业学术指导、伦理审查监督、研究资金支持等方式，加强对临床研究的监督管理和统筹协调，支持和组织开展临床研究学术交流和培训，促进临床研究的质量提升和效能提高。 第八条 在突发公共卫生事件应急响应期间，根据突发公共卫生事件应急响应范围，省级及以上卫生健康行政部门或其确定的专业机构，可以在科学论证的基础上，牵头组织省域范围内或全国范围内的临床研究。 医疗卫生机构自主开展的临床研究与上述研究发生冲突时，医疗卫生机构应优先保障完成上述研究，同时暂停医疗卫生机构自主开展的临床研究受试者新入组。 第二章 基本分类及原则性要求 第九条 根据研究者是否基于研究目的主动施加某种干预措施（以下简称研究性干预措施），临床研究可以分为观察性研究和干预性研究。 第十条 开展观察性研究，不得对研究对象施加研究性干预措施，不得使研究对象承担超出常规诊疗或疾病防控需要的额外健康（疾病）风险或经济负担。 研究对象因参加观察性研究接受超出常规诊疗或疾病防控需要的额外检查、检验、诊断等措施，可能造成的风险超出最小风险的，参照干预性研究管理。 第十一条 开展干预性研究，研究性干预措施应当符合医学的基本理论和伦理规范、具有扎实的前期研究基础、制定科学规范的研究方案和风险预案、通过科学性审查和伦理审查。 医疗卫生机构和研究者应当对干预性研究可能出现的风险进行评估，具备与风险相适应的处置能力，妥善保护干预性研究的研究对象（以下简称受试者）的健康权益，不得违反临床研究管理规定向受试者收取与研究相关的费用，对于受试者在受试过程中支出的合理费用还应当给予适当补偿。 干预性研究一般由三级医疗机构、设区的市级及以上卫生机构牵头开展，其他医疗卫生机构可以参与干预性研究。 研究性干预措施为临床干预措施的，应当建立多学科研究团队，成员必须包括具备相应执业资格的医师，研究过程中涉及的医学判断、临床决策应当由其作出，原则上主要研究者须具备相应的医师执业资格。 第十二条 以上市后药品、医疗器械等产品为研究性干预措施的临床研究，一般在遵循产品临床应用指导原则、临床诊疗指南和说明书的前提下开展。 当同时满足下列条件时，可以超出上述范围开展干预性研究。 （一）在临床研究管理体系完备的三级甲等医院或与之具有相同医疗技术水平和医疗保障能力的医院开展。 （二）针对严重危害人的生命健康或者严重影响生存质量且目前无确切有效干预措施的疾病，或者虽有确切有效的干预措施但不可获取或者研究性干预措施具有显著的卫生经济学效益。 （三）有体外实验手段、动物模型的，相关实验研究结果应当支持开展临床研究；或者观察性研究结果提示确有必要开展干预性研究。 （四）使用方法不超过现有说明书的用法用量，预期人体内药物浓度（或生物效应）可以达到有效浓度（或有效水平）；或使用方法虽超过现有说明书用法用量但有充分证据证明其安全性、耐受性良好，或具有明确的风险获益评估证据且具有良好风险控制措施。 第十三条 以手术和操作、物理治疗、心理治疗、行为干预、临床诊疗方案、群体性健康措施、生物医学技术等为干预措施的临床研究，应当使用已经批准上市的药品、医疗器械等产品并在产品批准的适用范围内或在符合产品临床应用指导原则的前提下开展。 第十四条 对已经得到充分验证的干预措施，不得开展无意义的重复性临床研究。 第三章 组织管理 第十五条 开展临床研究的医疗卫生机构应当设有临床研究管理委员会，并明确专门部门（以下称临床研究管理部门）负责临床研究管理。 医疗卫生机构应当为临床研究管理配备必要的管理人员和条件保障。 第十六条 临床研究管理委员会由医疗卫生机构相关负责人、相关职能部门负责人和临床研究专家代表组成，负责医疗卫生机构临床研究的决策、审核、管理和监督。 第十七条 临床研究管理部门在临床研究管理委员会指导下，负责临床研究的立项审查、过程管理、质量管理、合同管理、结项管理和档案管理等工作，并协调科学性审查和伦理审查。 第十八条 医疗卫生机构应当制定临床研究科学性审查管理制度、细则和工作程序，组织开展科学性审查。 第十九条 医疗卫生机构应当按照《涉及人的生物医学研究伦理审查办法》要求，建立医疗卫生机构伦理（审查）委员会，健全工作制度，提供工作条件，保障伦理（审查）委员会独立开展伦理审查。 第四章 立项管理 第二十条 临床研究实行医疗卫生机构立项制度，未经医疗卫生机构批准立项的临床研究不得实施。 根据法律法规等要求，临床研究涉及行政审批、备案、登记、注册等事项的，在未按要求完成上述事项之前，医疗卫生机构不得批准研究者启动实施临床研究。 第二十一条 主要研究者应当制定临床研究方案，并按照要求向医疗卫生机构临床研究管理部门提交临床研究方案和相关资料，接受全程管理。 第二十二条 医疗卫生机构应当按照科学性审查制度、细则和工作程序，独立开展科学性审查。 科学性审查的内容应当包括研究的合理性、必要性、可行性，以及研究目的、干预措施、研究假设、研究方法、样本量、研究终点、研究安全性等。 科学性审查的专家应覆盖临床研究所属专业领域和研究方法学领域。干预性研究的科学性审查一般应邀请本机构外专家参加。 第二十三条 医疗卫生机构伦理（审查）委员会按照工作制度，对临床研究独立开展伦理审查，确保临床研究符合伦理规范。 第二十四条 临床研究管理部门应当对提交的材料进行审核。有以下情形之一的，不予立项： （一）不符合法律、法规、规章及规范性文件要求的； （二）未通过科学性审查和伦理审查的； （三）违背科研诚信规范的； （四）研究前期准备不足，临床研究时机尚不成熟的； （五）临床研究经费不足以完成临床研究的； （六）药品、医疗器械等产品不符合使用规范的； （七）临床研究的安全风险超出实施医疗卫生机构和研究者可控范围的； （八）可能存在商业贿赂或其他不当利益关系的。 研究者应当签署利益冲突声明并与研究方案等一并提交医疗卫生机构审查，在发表研究结果时应当如实披露。 第二十五条 医疗卫生机构受其他机构委托、资助开展临床研究或者参与多中心临床研究的，应当与委托、资助机构或多中心临床研究牵头机构签订临床研究协议，明确双方权利、义务及责任分担等。 牵头机构对临床研究负主体责任，参与机构对本机构参与的临床研究内容负责。 参与机构应当根据自身情况对多中心研究中是否采用牵头机构科学性审查、伦理审查意见进行规定。 第二十六条 在医疗卫生机构立项审核通过时，临床研究的有关信息应当在国家医学研究登记备案信息系统（以下简称系统）按要求完成上传。鼓励医疗卫生机构和研究者在临床研究提出、科学性审查、伦理审查、立项审核等环节，实时在系统上传临床研究有关信息。 研究者应当如实、准确、完整填写临床研究信息，临床研究管理部门、伦理（审查）委员会等应当分别在系统填写并上传科学性审查、伦理审查和医疗卫生机构立项审核意见。 医疗卫生机构应当对临床研究信息的真实性、准确性、完整性等进行审核，并对相关内容负责，医疗卫生机构审核后完成信息上传。在系统填写临床研究信息，应当使用规范汉字，涉及专业术语的应当符合学术规范。 完成信息上传的临床研究由系统统一编号。 第二十七条 多中心研究由牵头医疗卫生机构的研究者在系统填写，牵头机构和参与机构的临床研究管理部门、伦理（审查）委员会根据要求在系统上确认或上传有关补充材料、提交审核意见，并分别对有关信息的真实性、准确性、完整性负责。 第二十八条 完成信息上传的临床研究有关信息，通过系统或国家卫生健康委明确的平台向社会公开，接受同行和社会监督。 第五章 财务管理 第二十九条 医疗卫生机构应当根据国家法律法规规定和文件要求，建立临床研究经费管理制度，对批准立项的临床研究经费纳入单位收支进行统一管理，专款专用。 医疗卫生机构内设科室、部门和个人不得私自收受临床研究经费及物品。 第三十条 研究者应当严格执行本医疗卫生机构规章制度，合理使用研究经费，不得擅自调整或挪作他用。 第三十一条 医疗卫生机构或研究者严禁违规向受试者或研究对象收取与研究相关的费用。 第六章 实施管理 第三十二条 研究者应当严格按照批准的方案开展临床研究，稳慎、积极推动临床研究开展，如实记录临床研究过程和结果并妥善保存，配合医疗卫生机构及卫生健康行政部门完成对临床研究的监督检查。 第三十三条 在研究过程中，研究者需要对已立项的临床研究项目进行变更的，应当向医疗卫生机构临床研究管理部门报告。 临床研究管理部门应当按照科学性审查和伦理审查制度组织评估，对涉及研究目的、研究方法、主要研究终点、统计方法以及研究对象等实质修改的，应当重新进行科学性和伦理审查。 对需要重新审查的，应当及时启动审查。 第三十四条 研究者可以申请暂停或终止临床研究。 申请暂停或终止临床研究的，应当向临床研究管理部门报告并说明原因。医疗卫生机构应当按照临床研究全过程管理制度，作出是否同意暂停或终止的决定。 暂停或终止的干预性临床研究，已经有受试者入组的，医疗卫生机构及研究者应当制定方案，妥善保障已经入组受试者的权益。 第三十五条 医疗卫生机构应当对临床研究实施全过程监管，定期组织开展核查。主要研究者应当对负责的临床研究定期自查，确保临床研究的顺利进行。 第三十六条 医疗卫生机构应当加强临床研究的安全性评价，制定并落实不良事件记录、报告和处理相关的规章制度和规范标准，根据不良事件的性质和严重程度及时作出继续、暂停或者终止已经批准的临床研究的决定，并妥善保障已经入组受试者的权益。 第三十七条 医疗卫生机构应当建立受试者争议和投诉的处理机制，科学判定是否有损害及其产生的原因，合理划分责任，按照约定或有关管理规定，对受到损害的受试者进行合理的补偿或赔偿。 医疗卫生机构应当建立受试者和研究对象损害风险预防、控制及财务保障机制。 第三十八条 临床研究过程中出现如下情形之一的，在充分考虑受试者安全的前提下，医疗卫生机构应当暂停或者终止研究。 （一）存在违反法律法规、规章的行为； （二）存在违背伦理原则或科研诚信原则的行为； （三）研究过程中发现相关药品、医疗器械可能存在严重质量缺陷； （四）发现临床研究存在严重安全风险； （五）存在商业贿赂或其他不当利益关系； （六）违规使用研究经费的行为。 第三十九条 医疗卫生机构应当建立临床研究源数据的管理体系，实现集中统一存储，保障临床研究数据在收集、记录、修改、处理和保存过程中的真实性、准确性、完整性、规范性、保密性，确保数据可查询、可溯源。 第四十条 医疗卫生机构应当加强临床研究档案管理，如实记录并妥善保管相关文书档案。自研究结束之日起，档案保存年限不少于10年。在确保安全的前提下，可以实行电子归档。 第四十一条 临床研究发生启动、方案调整、暂停、终止、完成等情形时，医疗卫生机构和研究者应当在系统及时更新临床研究信息。 第四十二条 临床研究实行结项报告制度。临床研究终止或完成时，研究者应当及时分析研究结果，形成全面、客观、准确的研究报告。 临床研究管理部门应当对研究报告进行审核，并对该临床研究结项。 结项后的研究报告应当在系统上传，并向同行公开，加强学术交流。 第七章 监督管理 第四十三条 省级卫生健康行政部门应当依托系统加强辖区内临床研究的监测、评估、分析，实施监督管理。跨省域开展的临床研究的监督管理，由牵头医疗卫生机构所在地省级卫生健康行政部门牵头实施，参与医疗卫生机构所在地省级卫生健康行政部门配合实施。 省级卫生健康行政部门发现医疗卫生机构违反本办法规定，应当要求其立即改正，停止违规开展的研究、妥善保护受试者权益；发现医疗卫生机构临床研究管理体系及临床研究过程管理存在系统性、结构性问题，应当要求医疗卫生机构暂停所有临床研究，进行整改；并按照相关法律法规给予行政处罚及处分。有关监督检查情况，应当定期通报。 被要求停止的临床研究，由省级卫生健康行政部门在系统更新该临床研究有关行政监管信息并予以公布。 第四十四条 省级及以上卫生健康行政部门设立的专家委员会或其遴选的专业机构，应当依托系统对辖区内医疗卫生机构开展的临床研究进行技术核查，对科学性不强、伦理不合规、研究过程管理不规范以及违反本办法有关规定的，应当及时建议其所在医疗卫生机构停止相关研究、妥善保护有关受试者的合法权益；发现医疗卫生机构临床研究技术管理体系及临床研究技术管理存在系统性、结构性问题，应当建议医疗卫生机构暂停所有临床研究，进行整改。 有关技术核查情况，应向有关卫生健康行政部门反馈并提出处理建议，定期向辖区医疗卫生机构通报。 第四十五条 医疗卫生机构应当加强本机构开展临床研究情况的监督检查，发现研究者擅自开展临床研究、实质性调整研究方案未经医疗卫生机构批准或者违规收受临床研究经费等，应当按照有关规定处理。 第四十六条 未经医疗卫生机构批准，研究者擅自开展临床研究、调整已批准研究方案或者违规收受临床研究经费的，省级卫生健康行政部门和医疗卫生机构应当按照相关规定予以相应处理；医疗卫生机构未履行监督管理职责的，由相关卫生健康行政部门依法处理。构成犯罪的，移交司法机关依法处理。 第八章 附则 第四十七条 干细胞临床研究按照《干细胞临床研究管理办法（试行）》管理，非产品研制的体细胞临床研究参照《干细胞临床研究管理办法（试行）》管理。 第四十八条 中医临床研究不纳入试点。 第四十九条 本办法自2021年10月1日起试行，此前有关规范性文件的要求与本办法不一致的，在试行期间，以本办法为准。 关于博济医药 临床研究服务： 博济医药拥有一支规模庞大、专业成熟的临床研究队伍，可提供包括医学、项目管理、监查、稽查、数据管理和统计分析、生物样本检测在内的临床试验全流程解决方案。截至2020年，博济医药服务的客户超1000家，完成800多项临床试验项目，助力客户获得新药证书60多项、生产批件超过80项。在有丰富的临床试验服务经验，服务项目涵盖临床研究各个领域，在肿瘤、肝病、消化等创新药领域拥有独特的临床服务体系。 博济医药在全国设有40多个临床监查网点，与全国近600个临床试验机构展开合作，并运用ORACLE OC/RDC及CTMS系统，控制临床数据采集的及时性、管理临床试验过程的规范性。

​昨日（9月8日），CDE发布了《药物临床研究有效性综合分析指导原则（征求意见稿）》和《药物临床试验随机分配指导原则（征求意见稿）》，两份文件涉及药物临床研究有效性分析和随机分配两个方面，征求意见时间均为1个月。 《药物临床研究有效性综合分析指导原则（征求意见稿）》共涵盖引言，单项临床研究概述，有效性结果的整体分析，亚组人群分析，与推荐给药剂量相关的临床信息分析，长期有效性、耐受性和停药分析，监管考虑，参考文献等8个方面，征求意见时间为1个月。 文件合集 《药物临床试验随机分配指导原则（征求意见稿）》共涵盖概述，临床试验中常用的随机分配方法，临床试验中随机分配的实施和管理，其他考虑，参考文献等5个方面，征求意见时间为1个月。 文件合集 关于博济医药 临床研究服务：博济医药拥有一支规模庞大、专业成熟的临床研究队伍，可提供包括医学、项目管理、监查、稽查、数据管理和统计分析、生物样本检测在内的临床试验全流程解决方案。截至2020年，博济医药服务的客户超1000家，完成800多项临床试验项目，助力客户获得新药证书60多项、生产批件超过80项。在有丰富的临床试验服务经验，服务项目涵盖临床研究各个领域，在肿瘤、肝病、消化等创新药领域拥有独特的临床服务体系。 博济医药在全国设有40多个临床监查网点，与全国近600个临床试验机构展开合作，并运用ORACLE OC/RDC及CTMS系统，控制临床数据采集的及时性、管理临床试验过程的规范性。

今天（7月30日），由博济医药提供全程CRO服务的重组人红细胞生成素（Fc）融合蛋白注射液I期临床研究（简称“rhEPO-Fc项目”）顺利完成，标志着rhEPO-Fc项目整体工作稳步快速推进。 rhEPO-Fc项目是由大湾生物控股有限公司（简称大湾生物）旗下子公司广州太力生物医药科技有限公司自主研发的创新型1类治疗用生物制品，其I期临床研究在广东省人民医院开展，由博济医药提供全程CRO服务。 rhEPO-Fc项目I期临床试验结果积极。根据所得研究数据，后续临床试验可根据现有结果开发延长给药间隔之后的安全性和疗效，与目前国内2-3次/周使用的EPO相比，本品后续给药方案有望调整至2周一次或更长的间隔时间。在安全性方面，本项目研究过程中未发生与药物有关的严重不良事件及免疫原性问题。研究者及相关专家一致认为，本品安全性、耐受性良好、半衰期显著延长，可以顺利进行后续的临床研究。 大湾生物CEO及联合创始人陈亮博士表示：“我们很高兴能够看到rhEPO-Fc项目取得阶段性的进展，这也是长效EPO药物面世的重要步骤，本次合作深刻感受到了广东省人民医院和博济医药的专业性和执行力。长效EPO临床项目顺利开展，将为中国肾病患者带来福祉！” 博济医药相关负责人表示，rhEPO-Fc项目I期临床研究的顺利完成是大湾生物、广东省人民医院、博济医药等多方共同努力的卓越成果。在后续研究中，博济医药将与各方继续保持积极配合和紧密对接，助力rhEPO-Fc项目取得更大进展，造福人类生命健康。关于大湾生物： 大湾生物总部位于香港，是一家致力于将人工智能前沿技术应用于药物开发平台的高新技术企业，解决了药物开发成功率低、周期长、成本高等诸多痛点。公司拥有3100平方米的研发实验楼，成功将多个生物药推入BLA阶段，其中包括多个国家I类新药。公司自成立以来，在开发多个国家新药过程中，积累了大量实验数据，创建了智能化集成数据库，通过深度学习，将打造新一代人工智能化药物研发生态系统。关于博济医药 临床研究服务： 博济医药拥有一支规模庞大、专业成熟的临床研究队伍，可提供包括医学、项目管理、监查、稽查、数据管理和统计分析、生物样本检测在内的临床试验全流程解决方案。截至2020年，博济医药服务的客户超1000家，完成800多项临床试验项目，助力客户获得新药证书60多项、生产批件超过80项。在有丰富的临床试验服务经验，服务项目涵盖临床研究各个领域，在肿瘤、肝病、消化等创新药领域拥有独特的临床服务体系。 博济医药在全国设有40多个临床监查网点，与全国近600个临床试验机构展开合作，并运用ORACLE OC/RDC及CTMS系统，控制临床数据采集的及时性、管理临床试验过程的规范性。

本期《袁来如此》为系列文章《大分子生物分析概论》的第十三篇，旨在根据已发表的文献资料，对评估药物临床前PK/PD时，开发和选择LBA方法的策略作初步介绍。 由于内容篇幅较长，本文将采取上下篇形式进行推送，敬请垂注！《袁来如此》专栏系广州博济医药微信公众号打造的科普学术专栏，内容均为博济医药子公司深圳博瑞副总经理袁智博士原创。1.导论 药物发现是一个快速的transformative的过程，其包括靶标识别、靶标验证、先导药物的识别和优化。随着项目推进经过这些阶段，对生物分析的需求也在相应地改变。开发合适的生物分析方法可以提供药代动力学和药效动力学（PK/PD）的宝贵数据，以支持在新药研发项目不同阶段中关键的药效和安全性研究，从而为项目的进展奠定坚实的基础。在新药早期的发现阶段，会同时考虑不同药物模式（drug modalities）的多个分子。一般有多种模式可供选择，取决于靶标及其位置，例如，传统的小分子、多肽、单克隆抗体、抗体-药物偶联物、纳米抗体、融合蛋白药物、双特异性生物药和寡核苷酸。在生物技术产业中，药物的快速发现以及快速开发正推动着生物分析领域的发展和演进。这种演进的主要内容是，缩短分析运行时间，实施multiplex分析，提高灵敏度，降低样品体积的消耗，实现分析测试的自动化。 本文关注的重点是临床前蛋白药物生物分析方法的开发策略，即LBA分析平台的选择和方法开发中的关键注意事项。本系列之前的文章，基本是关注用于临床样本分析的LBA方法。为了简单起见，在此文中仅评估用于检测蛋白药物的sandwich format的LBA，而蛋白药物在大多数情况下，意味着单克隆抗体。虽然相关技术有多方面的进步，本文将重点关注已经商业化和在生物分析行业十分流行的技术。文末的参考可以引导读者非常详细地了解相关内容。 目前最流行的3种技术是ELISA、电化学发光（ECL、MSD、NJ、USA）和Gyrolab®（Gyros Protein Technologies、Uppsala、Sweden）。 同时，本文会简要地涵盖以下几项不经常使用但具有超高灵敏度的技术：如基于Single Molecule Array平台（单分子阵列，Simoa™），单分子计数[SMC™]的Erenna® 平台（Singulex Inc、CA、USA），免疫聚合酶链反应平台（immuno-polymerase chain reaction、immuno-PCR、 Imperacer®、Chimera Biotec GmbH、Dortmund、Germany）。另外，还会简要介绍multiplexing的Luminex平台（Luminex xMAPR、Luminex Corporation、TX、USA）。在药物发现阶段，分析方法开发是生物分析的主要内容之一，同时，应当特别考虑评估耐受性（tolerance）和分子完整性（molecular integrity）。2.临床前LBA方法的关键参数 用于药物发现阶段的生物分析方法有5个重要参数：样品体积要求，定量的动态范围，测试运行时间，灵敏度和自动化程度。本文将简要地评估这些参数，并介绍这些参数在选择检测平台时发挥的重要作用。 1) 样本体积消耗 从小鼠身上单次采集的血清或血浆样本的体积约为50ml。随着在动物研究中尝试实施3R（替换replacement，减少reduction 和细化refinement ），生物分析业界正在探索多种微体积采样方法，而这将进一步大幅度地减少样本体积。另外，在分析小鼠脑脊液等基质的样本时，只有2-5ml的体积可用。考虑到有可能意外损失样本，故从动物获得的样本体积应足以分析样本至少两次。因此，应当首选能够使用低样本体积的分析技术和平台。 2) 定量动态范围 能够在宽广的动态范围内，至少包含3-4个数量级，进行定量分析是极其有益的。对于PK分析，这允许较高的最小稀释要求（minimum required dilution，MRD），以尽量减少样本基质效应，同时为低剂量给药的样本提供所需的定量灵敏度。同样，对于PD，它允许在更宽广的范围内测试平行性（parallelism），从而允许对含有高浓度生物标志物的样品进行大幅度的稀释。对于生物标志物测量，稀释还有助于最大限度地减少样本和基于缓冲液的标准曲线（替代基质）之间的基质差异，从而更精确地生成定量数据。 3) 分析运行时间 分析运行时间是实施PK/PD样本分析所需时间，假定使用之前已为该应用开发分析方法，这也意味着假定试剂已标记，缓冲液已制备，并且相关仪器也已准备就绪。在non-GLP临床前生物分析实验室中，时间是至关重要的；在大多数情况下，最终目标是提供可靠，且可以重现的数据，同时保持较短的分析运行时间。这就提高了实验室的效率，并允许该部门同时支持多个项目。分析96样本微孔板的运行时间可以在1-5小时的范围之间，具体取决于采用的分析技术（对于某些分析技术，有额外的隔夜捕获步骤overnight capture step）。 4) 灵敏度 大多数传统的单克隆抗体的PK定量LLOQ在几个ng/ml范围。一些高效力药物分子（需要低剂量）和低丰度（或下调了的）的生物标志物可能需要更高的灵敏度。应当依据个案的情况为这些应用选择相应的分析平台。此外，高灵敏度的分析方法是高度依赖所使用的试剂，因此获得高特异性和高亲和力的试剂可以大大提高定量的灵敏度。提升分析灵敏度也同时降低了对样本体积的要求，见1）。 5) 自动化 自动化平台可缩短分析人员操作的时间，提高生物分析部门的效率。在临床前药物开发的环境中，分析平台的完全自动化，在需要开发分析方法且进行常规样本分析的情况下是非常有益的。同时，对于方法开发，优化和因基质或物种变化而进行的方法认证，需要能够修改自动化平台上的检测方法的灵活性。 除了分析测试自动化之外，还可以自动化地制备标准品（standards）和质量控制样品（QCs），从而节省时间，降低珍贵参照（比）物料（reference material）的使用和成本，并减少手动移液产生的误差。一些分析测试平台，如Gyrolab，允许检测的全自动化，而Hamilton和HPD300这样的平台，则可以允许自动化移液体，或制备标准品和QCs。超高灵敏度的Simoa™平台也支持自动化地样本检测。3.临床前LBA免疫测试平台 目前，有多种LBA测试平台在新药开发中得到应用。表1列出了若干LBA测试平台及其比较。本文将进一步介绍其中几种在生物分析行业中应用比较广泛的平台。由于为临床前研究开发分析方法所选择的LBA平台，很可能会继续在临床研究中继续使用，因此，选择合适的测试平台，将会是影响深远的一个重大决定。表1. 若干LBA测试平台相关特征的比较备注：上表中的方法未全部在文中详细介绍。 近年来，一系列immunoassay的新技术，特别是基于微（磁）珠（beads，magnetic，etc.）的技术，从测试格式的物理学/物理化学层次，待测物的捕获，检测信号的收集/放大，数据处理等方面，实现了显著改善，并取得了相当的商业性成功，虽然这些新方法在化学和生物学层次，仍然是基于抗体-抗原的结合作用以及基本的夹心式immunoassay。本文选择若干得到广泛商业应用的测试平台，及其在临床前生物分析方法开发的应用作初步介绍，希望起到抛砖引玉的目的，引发更多关于新的分析测试技术的开发和应用的相关讨论、交流和研究。ELISA平台 ELISA是生物制药行业内外使用最广泛的配体结合式（LBA）检测平台。ELISA的测试格式包括直接式、间接式和夹心式；ELISA经常用作与开发中的新分析平台进行比较的基础；在96孔板上，通常对样本进行复孔（duplicate）测定，手动或半自动运行。通常使用比色法的检测试剂，但有时也使用其他检测试剂，如发光（luminescence）和荧光（fluorescence）。通常，对ELISA方法，需要监测试剂，如抗体（antibodies）、配体（ligands）、缓冲液（buffers）以及批次的变化。 几十年来，传统的ELISA一直是蛋白质定量分析最常用的技术，因此也是最可靠的技术之一。即使在今天，大多数生物标志物的商业检测试剂盒都是基于ELISA的。多数新分析技术都与作为金标准的ELISA比较。但是，这种分析技术也有缺点，例如，测试运行时间约长为 4-5 小时，样品体积消耗大（测定体积为100 ml），灵敏度低与LLOQ在大多数情况下接近低-中ng/ml，以及狭窄定量动态范围（2-3 数量级）。这项技术对于某些临床前生物分析的应用仍然很有吸引力，比如血清单克隆抗体的PK。该平台还提供了在方法开发早期阶段评估测试方法不同部分的灵活性。表2列出了不同检测平台的性能，以一个mAb药物为例。表2. 与ELISA比色法检测相比较，一个mAb在若干检测平台上LBA方法参数的比较备注：上表中的方法未全部在文中详细介绍。电化学发光(Electrochemiluminescence，MSD)平台MSD平台是一种基于微孔板的测试格式，它利用电化学发光（ECL）信号进行检测。在这个平台上，免疫测试格式类似于用于药物定量和target sample measurements的典型ELISA格式，但预计灵敏度会因使用化学发光而增加。MSD平台似乎主要在检测信号的产生和收集上，相对于ELISA有显著改善：MSD采用SULFO-TAG（三联吡啶钌）是一种发光底物，其分子量约为1000Da（大约是HRP的1/40），因此空间位阻小，易于标记抗体，且不易妨碍其与待测物或其它抗体的结合。SULFO-TAG在阳极表面失去电子，发生氧化，在三丙胺阳离子自由基的催化及三角形脉冲电压激发下，可产生高效、稳定、连续的电化学发光信号，使得检测信号增强并稳定（见图1）。图1. MSD的电化学发光产生的检测信号 MSD的电化学发光技术在生物分析行业广受欢迎。它保持了ELISA格式的优点，如方法开发的灵活性，另外在其它领域也非常出色，如较小的样品体积要求（测定体积为25–30 ml），更高的灵敏度（低-中pg/ml）和宽泛的动态范围（4-5个数量级）。当以均相的测试格式运行时，此平台可能受到钩效应（hook effect）的影响。钩效应起源于不合适的抗体-抗原浓度比例，但是可以减轻甚至消除的。此外，试剂和微孔板容易有批次间的变化，因此，强烈建议在批次之间进行交叉比较。 MSD微孔板的孔底为石墨底，捕获抗体包被载量可提升10-50倍，检测范围比ELISA扩展了10-100倍，定量动态范围高达5-6个数量级，灵敏度可提升10-1000倍（fg/ml-pg/ml级别）。根据对血清免疫学中的“带现象”的理解，可推测：包被抗体载量可以根据检测灵敏度的需要进行调整，以避免钩效应（hook effect）。分析运行时间接近约3-4小时，但考虑到该平台提供的其它优势，测试时间可被视为一个合理的折中。该平台允许同时运行多个96孔板，因此在分析数百个样品时，测试一个或多个96孔板也只需要基本相同的时间，这一点可能非常有利。此平台不是自动化的，因为它需要分析人员参与每个步骤。此外，该平台还提供与实验室信息管理系统（LIMS）的集成和US FDA 21 CFR part 11的合规性，允许分析方法结果容易地转移到GLP的环境中。Gyrolab平台 Gyrolab是一个非96微孔板的免疫测试平台，具有液体处理功能（liquid handling capability），使用小体积的样本和试剂在光盘（CD）上实施免疫测定。该测试格式使用biotinylated捕获试剂和标记有fluorophore的检测试剂，在纳升体积的使用亲和力微珠填料的捕获柱（nanoliter volume affinity capture column）上进行测试。利用CD的微观结构确定样品和试剂的体积，并通过旋转CD将样本加到捕获柱上。在每个CD上，有96（在1000nlCD上）-112（在20或200nl CD上）个微观结构，可产生96-112个数据点（1小时/CD运行时间）。在Gyrolab工作站上，样品处理完全自动化，液体处理臂将样品和试剂从微孔板转移到CD，并通过激光/检测器测定每个捕获柱的荧光信号。基础的Gyrolab xPlore™ 允许无人值守地一次分析1张CD，而Gyrolab xPand™允许分析多达5张CD（即480-560个数据点）。在大多数情况下，动态范围为3-4个数量级。该平台的灵敏度可与MSD的ECL平台（低-中pg/ml）相媲美。 Gyrolab是一个自动化的微流体系统（microfluidic system），且其离心操作能够高效地处理微量体积，因此大多数重复(duplicate）分析只需要小于5ml的样本体积，就可以从同一微孔板重新分析未使用的样品。该平台使用包被了捕获抗体的微珠来捕获待测物，与下面讨论的Luminex和Simoa平台在捕获待测物的原理上，即在更大的固相表面积上有更多的捕获抗体（与ELISA相比），似乎有异曲同工之妙，总体效果是提升了捕获待测物的效率，提升了灵敏度。Gyrolab的一个出色特点是，可以选择不同的CD来调整定量的动态范围，以满足对低或高浓度样本的分析。该分析技术平台对于大分子的常规临床前PK/PD分析无疑是非常有效的。此平台在缩短检测时间方面非常有效，无需人工移液和参与分析的每一步骤。这使得该平台对开发方法和分析样本都极具吸引力。此外，该平台还提供实验室信息管理系统集成和FDA 21 CFR part 11合规性，能够将分析方法轻松地转移到GLP环境中去。 Gyros的一个可能缺点是，如果以基于微孔板格式开发了分析方法检测，则相同的试剂在转移到Gyros时可能会性能欠佳，并且可能需要显著地优化才能获得最佳性能。这是因为Gyros的孵育时间极短，需要高结合效率的捕获试剂，而基于微孔板的检测则不需要这种试剂，因为较长的孵育时间抵消了该需求。因此，如果使用Gyros，则需要在同一平台对试剂进行筛选，然后测试其分析性能，并开发完整的分析方法。BIAcore平台 基于BIAcore平台的药物分析，依赖于待测物与固定在传感器芯片（sensor chip surface）表面的待测物特异的试剂的相互作用。BIAcore实时监测该结合相互作用，并读出以相对响应单元（relative response units，RU）为单位的响应，该响应与Surface Plasmon Resonance（SPR）角度的变化相关，并且由传感器芯片表面的液体薄膜的折射率变化所决定。折射率的变化与芯片表面结合的质量成正比。这种实时的无标记技术与典型的免疫测定法有很大的不同，免疫测定法需要多个孵育和洗涤步骤，以及用于信号读出的标记检测抗体（labeled detection antibody）。对于临床前药物分析，可以将抗药物特异性抗体固定在芯片表面实施通用化检测，当样本流经分析隔室（cell）时，该抗体将结合样本中所含有的mAb药物。其它方式，如在芯片上固定待测物，也可用于特定的定量分析。对于此平台，在验证期间必须经过10个周期的残留（carry-over）测试，并且还应确定最大信号值（相对于背景值）的信号噪声比（signal-to-noise ratio），以评估样本分析期间的方法运行性能。此外，还必须评估在执行大批量样本分析的较长时期内的芯片稳定性（分析方法是特定于所使用的芯片类型）。由于该平台通常运行一夜或更长时间，故样本和试剂的稳定性必须比典型的免疫测试方法具有更长的短期稳定性（超过24小时），而且在Biacore T200上，样本的总通量（overall sample throughput）较低。此外，单个分析运行需要包含校准曲线后和运行序列中间隔的QC样本。通常，这对应于一个微孔板的校准品（calibration standards，Cs）和样本。 可以对BIAcore实施IQ/OQ/PQ验证，以满足符合21 CFR Part 11的要求。使BIAcore仪器达到GLP合规的状态不是一个简单的过程，需要投入大量时间来处理数据传输（data transfer）和合适的校准（随时间推移的）等问题。 该测试平台更多地用于LBA关键试剂的筛选和表征。LBA关键试剂一般定义为：对待测物（analyte）特异性的LBA分析试剂，如抗体、多肽、蛋白质、耦合物（标记），作为试剂的药物和ADA试剂（阳性和阴性对照品）。多通道（multiplexing）分析技术 Multiplexing测试方法可以节省时间和宝贵的样品。但是，存在一个局限：即它们经过严格优化，只能在指定范围和基质中使用。不同的待测物对不同的基质和稀释的反应不同，因此，对于某个待测物，优化参数的偏差可能需要重新优化整个multiplexing检测方法。在临床前生物分析中，需要探索了解多种药物、多个药物变异体、多种药物的组合和多种生物标志物。因此，检测的灵活性是非常关键的，对此multiplexing可能帮助意义不是很大。 在样本体积十分有限的特殊情况下，可以探索multiplexing。允许自主开发multiplexing方法的平台包括：Luminex的xMAP技术，使用独特的dyed beads，并取决于所使用的仪器（MAGPIX、LUMINEX 200或FLEXMAP 3D），可以分析50-500待测物；Quanterix SR-X，使用6个独特的磁珠，可以multiplexing多达6个待测物；Quanterix SP-X可以multiplexing到10个待测物，使用其基于平面阵列的空间分离的化学发光成像技术。其中，MSD允许从黄金标准的singleplex平台直接转换到U-PLEX平台进行检测；Quanterix的SR-X和SP-X平台在multiplexing时能够提供超高灵敏度。Luminex平台 常用的Luminex®100/200™系统是基于流式细胞学（flow cytometry）原理的灵活程度很高的分析仪。该系统使用很小的样本体积，在单个微孔板的孔/井中multiplex（同时测定）多达100个待测物。该平台可以操作许多检测格式，包括核酸测试方法（nucleic acid assays）、受体-配体测试方法（receptor-ligand assays）、免疫测试方法（immunoassays）和酶测试方法（enzymatic assays），并提供快速且经济高效的生物测试结果。 该系统是xMAP® 3个核心检测技术的组合。第1个是xMAP微球，这是一个荧光染色，微米大小的聚苯乙烯微球系列，既作为标识符，又充当建立测试方法的固体表面。第2个是基于流式细胞学的仪器（flow cytometry-based instrument），Luminex 100/200分析仪集成了关键的xMAP检测组件，如激光、光学器件、流体技术和高速数字信号处理器。第3个组件是xPONENT®软件，它专门设计为基于方案（protocol-based）的数据采集方式，具有强大的数据回归分析的能力。 Luminex利用特定染料的珠子（beads），该珠子包被有特定的抗待测物抗体。添加待测物孵育后，再添加荧光标记的抗体，以检测和定量待测物。此项技术使用供应商预先生产的试剂盒，主要用于PD检测，即生物标志物的定量分析，并且采用多通路检测（multiplexing）的方式。商业化的试剂盒数量巨大，据称达1,300余种。一个样本可以用于测定多个待测物，据称最多可达500个，并且可以对每种待测物设置接受标准。不足之处是：不同待测物珠子（analyte beads）有交互干扰（cross-talk）的倾向，而且测试方法对光敏感，因此必须采取特殊的预防措施。超高灵敏的定量分析技术 对于某些药物和样本基质，可能需要具有fg/ml-低pg/ml的超高灵敏度的定量分析方法。相关状况包括定量低丰度的生物标志物，对强效药物分子的PK分析和定量极易受到基质效应影响的待测物，显然，大幅度稀释样本会提升对测定平台灵敏度和定量动态范围的要求。 目前，允许自主开发方法的超高灵敏度的定量分析平台包括来自Quanterix，基于Simoa™的数字化ELISA，来自Singulex的使用单分子计数（single molecule counting）的Erenna™，以及来自Chimera Biotec GmbH的基于免疫PCR（immuno-PCR）的Imperacer。 之前已经发表的文章详细评估了这3种超高灵敏度的分析技术，以及其它不太流行的分析技术。这3种技术都是需要供应商提供检测方法的分析仪器，但都允许用户自主开发检测方法。当拥有实时定量PCR（qPCR）仪器（thermal cycler fitted with a fluorimeter）时，还可以独立于供应商提供的试剂或仪器开发Immuno-PCR方法。在使用这些技术时，需要特别注意一些非常规情况，包括Simoa™ 的磁珠偶合，DNA与检测试剂的偶合，以及无污染地操作immuno-PCR。基于单分子阵列（Simoa™）的数字化ELISA 来自Quanterix公司的Simoa™数字化ELISA是一个很有前途的平台，它可以使蛋白质定量达到fg/ml。该技术采用基于微观顺磁珠（microscopic paramagnetic bead）的免疫测试方法，并结合独特的信号检测和数据采集系统。数字化ELISA分2个阶段实施。在捕获抗原的第1阶段，涂有捕获试剂的微观磁珠与样品混合，然后加入生物素标记的检测抗体（biotinlabeled detection antibody）和链球菌素-β-半乳糖酶（streptavidin–b-galactosidase）。然后，这些珠子被加载到光盘上，光盘上装有一系列体积为飞升（femtoliter）大小的微井阵列。每个微井的直径为4.5mm，能够容纳直径为2.7mm的珠子数目只能为1或者为0。被硅胶垫片密封的微井含有荧光底物，其用于信号生成和放大（图2）。Simoa™ 技术在定量分析的第二阶段采用了独特的信号检测系统。微井（50飞升）中浓度相对较高的发出荧光的产物（阳性事件）和白光散射（white light scattering）测定的总珠子负载可以由标准的CCD摄像机轻松地检测到和记录。通过改进几个检测步骤，Simoa™ 实现了超高灵敏度。图2. 在飞升体积（femtoliter）的井阵列中装载，密封和成像单个顺磁珠 因为在100mL的反应体积中有约200,000个磁珠，而每个磁珠捕获约80,000个抗体分子，抗体-待测蛋白的比值和平衡允许高效地在给定的示例中，>70%捕获待测物。由于溶液中有这么多的磁珠，而且可以在溶液中运动，所以捕获效率进一步提高，因为每个目标蛋白在不到1分钟时间内就会遇到磁珠。这与传统的LBA方法中，固定在一个表面的捕获抗体与待测物的缓慢结合完全相反。另外，优化了的biotin-labeled detection antibody与streptavidin–b-galactosidase之间的比值，可减少检测背景并最大化特定信号的采集。与Simoa™检测系统相结合，相关荧光信号可以通过荧光底物（fluorogenic substrate）的酶消化（enzymatic digestion），而进一步放大。 Simoa™ 检测系统能够检测到单个结合事件（a single binding event），该事件可以在低浓度下以数字方式获得（灵敏度增高，数字化ELISA），或在高浓度模式下以模拟的方式获得（扩展了的定量动态范围）。荧光用于检测酶活性，并能够测定每个磁珠上酶的平均值。与下面描述的Erenna®平台一样，结合数字式和模拟式的读数功能，可以实现非常宽广的定量动态范围。由于最终信号采集是在平面阵列上完成标准成像，因此与使用 Erenna®等流体系统的数值读出相比，数据采集更快。 尽管Erenna® 和Simoa™ 平台具有数字读出和宽广的定量动态范围等共同点，但Simoa™ 平台是一个完全自动化的系统，该仪器可以实施样品稀释（高达1:10稀释），混合，洗涤，孵化和数据采集步骤。Simoa™ 能够同时测定多达10种不同的待测物（multiplexing）。这是通过对单个捕获抗体使用不同的dye linkers来实现的。之后，对阵列进行多个波长的荧光成像，以识别拥有不同dye linkers的亚组，并确定是否存在enzyme reporter标记。与Singulex和Quanterix一样，有许多试剂盒可供选择。也可以“定制”开发，或“自主开发”分析方法。 凭借较高的灵敏度、multiplexing和自动化功能，该平台看起来非常理想。Simoa™平台与LIMS系统兼容，其软件满足监管级别的生物分析据FDA 21 CFR part 11的合规性要求。笔者认为该平台因其超高灵敏度（可以使用微量样本体积）和自动化操作，在相当的程度上可以替代Gyrolab平台，用于临床前PK样本分析。Singulex Erenna®平台 Erenna®免疫测试系统利用两步的过程实现超高灵敏度定量分析（ultrasensitive assays）。最初，使用biotinylated capture试剂和荧光标记检测试剂，在96孔板中实施基于珠子（beads）的夹心式测试格式。从珠子上洗脱的被捕获待测物被转移到一个384孔的读取板（reading plate），然后将该读取板放置到检测仪器上。然后样本一个接一个地通过毛细管进入flow cell，并在其中实施激光诱导的单分子检测分析。该平台的优势是宽广的定量动态范围，其通过独特的软件曲线拟合算法实现。该算法利用了多次读数，提升了灵敏度。 与其它测试平台相比，检测时间较长，但一些线下的自动化设备可用于洗涤和转移步骤。该平台通常用于PD检测，但也可用于PK定量分析。对供应商生产和供应的试剂盒，其稳定性必须由最终用户评估，因为试剂的稳定性通常是未知的。此外，可以购买通用试剂，以开发内部的检测试剂，而且，基于微孔板的格式也能兼容使用96或384孔板的平台。供应商建议对校准品（Cs）进行3次复测（triplicate），以便在低浓度下进行精确分析。可以通过IQ/OQ程序，与内部PQ相结合，验证Erenna®平台。如果将Erenna®与LIMS结合，以实施监管级生物分析，则一个选择是使用读出的三个信号之一进行浓度分析。但是，动态范围和灵敏度可能会受到影响，具体取决于选择哪个读出的信号。Immuno-PCR (Polymerase Chain Reaction) Immuno-PCR（Chimera）是一种扩增免疫测试技术（signal amplification immunoassay）。它涉及DNA标记的检测抗体的扩增，从而提高灵敏度。与ELISA中使用的抗体-酶偶合物（antibody–enzyme conjugates）不同，IPCR中的关键试剂是抗体-DNA偶合物（antibody–DNA conjugates），其中一个DNA标记（marker）与检测抗体相偶合。然后，将DNA polymerase加入到反应主混合物之中，就可以放大检测信号，并通过定量PCR（qPCR）而定量测定DNA-marker的浓度，从而定量分析analyte–antibody immunocomplex。因此，该技术主要改进了检测信号的放大方法。但是，如果检测抗体与血清或血浆中的成分发生交叉反应，该平台可能容易受到强大基质效应的影响。因此，在方法验证期间必须评估信噪比，并用于确定样本分析期间方法的性能。 该平台的优点包括宽广的定量动态范围和提升了的灵敏度，这对PD分析是很有益的。与 Erenna®平台一样，检测试剂高度依赖于供应商，对于大批量样本分析来说，成本可能很高。如同MSD、Erenna®和其它基于珠子的平台一样，应特别注意标记试剂和微孔板批次的变化。由于该平台依赖于PCR技术，因此在处理样本、试剂和移液器枪头时必须小心谨慎，以避免污染。此外，数据分析可能也会较为麻烦（cumbersome）。7. 特别声明 本文如有疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有引用的原始信息和资料均来自已经发表学术期刊, 官方网络报道等公开渠道, 不涉及任何保密信息。 参考文献的选择考虑到多样化但也不可能完备。欢迎读者提供有价值的文献及其评估。参 考 文 献 1. 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